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该系统为Cytiva公司(原GE公司)的Biacore T200。Biacore系列产品是分子间相互作用检测领域研发最早、性能最好、市场占有率最高的检测设备,其技术被认为是分子互作检测领域的金标准技术,被中国、美国和日本药典所收录,利用其发表的文章年均>1000篇。T200型号被认为是Biacore系列中最经典型号之一,具有超高灵敏度、超高数据质量、超低样本消耗和独特“分子垂钓”功能。
Biacore T200是基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术来实时跟踪生物分子间的相互作用。其技术特点为实时、无任何标记地测量活性分子之间相互作用,噪音小,基线噪音值非常低,并对被检测物无分子量检测下限,既能够检测大分子也能够检测小分子,满足中药分子和靶蛋白的分子量需求。Biacore T200在中医药研究中具有非常广泛的应用,在中药作用机理解析、中药复方活性成分确认、中药活性成分分离与确认、基于靶点的药物筛选、药靶结合位点验证、靶点发现与确认等方面已成为不可或缺的研究设备。
应用范围
该系统能够实时、直接、动态的观测分子间相互作用的全过程,并给出其结合的特异性,结合强弱(即亲和力)以及分子识别的快慢与结合复合体的稳定性(动力学),阐述多个分子(或亚基)之间的组装过程以及顺序,作用机制以及构效关系。由于分析过程无需引入外源探针、荧光素、酶类等标记分子,因此可以更真实的反映分子间的相互作用状态。
其主要检测指标包括:
1. 亲和力和动力学数据
Biacore T200可提供分子之间相互作用的亲和力检测,获取亲和常数(Kd),其范围可从10-14至10-3M;同时可获取从103到3×109 M-1S-1的结合速率常数(ka)以及从10-5到1S-1的解离速率常数(kd)。这种非常宽的动力学常数检测范围能够检测最快的结合以及最慢的解离,有助于区分亲和力数值相近但动力学性制截然不同的分子间相互作用,对候选药物分子选择性的提高有着极大的帮助。
2.结合特异性和选择性研究
Biacore T200 独特的微流控系统拥有四个流通池,可单个、配对或者串联使用,通过在线参比通道设计能够实际呈现样品的非特异结合情况,并且实时自动的参比扣减设计,能够最大程度的扣除非特异结合对结果的影响,从而确保结合特异性和选择性的研究。同时,通过自有数据分析软件的拟合直观显示数据质量,帮助用户判断拟合数据的可靠性,有效避免用户仅凭主观判断得到错误结果。
3.浓度定量分析
Biacore T200系统即可开展基于标准曲线的相对浓度定量也可开展不依赖标准曲线的绝对浓度定量。在相对浓度定量分析中,自有软件可以通过直接法或竞争法实现对目标分子活性浓度而不是总蛋白含量的测定,自动生成高精确的可重复数据, 其CV值通常小于5%。在绝对浓度定量分析中,其通过目标分子在溶液中的扩散效应,检测不同流速进样的目标分子与芯片表面结合速率的变化,在不需要标准品也不需要做标准曲线的情况下,同样能够检测目标分子的绝对浓度。这一方法在治疗药物、疫苗、免疫治疗性蛋白质开发及预测药物效价等方面具有十分重要价值。
4.热力学分析
Biacore T200系统的专用软件向导程序、内置缓冲液脱气装置以及精确的温度控制系统通过测定不同温度下动力学常数,利用范德霍夫方程即可计算出过渡态的热动力学参数,包括熵变(ΔS)、焓变(ΔH)、吉布斯自由能(ΔG)等数据,从而揭示分子间相互作用的驱动力。通过该热力学分析能够预测蛋白复合体的三维结构形成过程中的能量变化,从而更全面的了解分子识别的机制,为基于结构的药物设计提供数据基础。