佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是芸香科柑橘属植物，以近成熟果实纵切薄片干燥后入药。佛手饮片以片大、绿皮白肉、香气浓厚者为佳。在我国产区分布广泛，其中产自四川或重庆的川佛手，果实如握拳形，又称“拳佛手”。

　　黄璐琦院士在四川泸定县资源考察时，发现部分佛手树上除正常果外，还有与柑橘形态相似、呈扁圆形的异形果。异形果的出现严重影响佛手药材和饮片品质，揭示异形果形成的分子机制，可为川佛手果形及品质调控研究奠定基础。

　　近日，中国中医科学院等单位在Plant Physiology and Biochemistry杂志发表题为“Genome-wide analysis of Citrus medica ABC transporters reveals the  regulation of fruit development by CmABCB19 and CmABCC10”的研究论文。该研究在比较转录组和基因家族分析的基础上，通过酿酒酵母遗传转化体系、烟草瞬时转化体系及拟南芥遗传转化体系，发现转运蛋白CmABCB19与CmABCC10会导致果实中生长素及类黄酮成分的变化，进而引发果实表观性状及内在品质特征改变。

　　该研究首先比较佛手正常果和异形果的形态。正常果体积大，呈长圆形，果面深皱或疣状凸起，果实顶端是指状裂瓣；异形果体积偏小，呈扁圆形，果面较平滑，末端的指状裂瓣合生。进而对佛手正常果和异形果进行转录组测序，KEGG富集分析表明差异表达基因主要富集在ABC转运蛋白、碳代谢、碳固定、氨基酸的生物合成等通路，GO富集分析主要富集在转运蛋白通路、跨膜转运活性等功能。

　　在此基础上，对佛手ABC转运蛋白家族进行鉴定。佛手ABC转运蛋白共有119个成员，可分为8个亚家族，ABCG亚家族有43条基因，成员最多；其次为ABCB亚家族，有28条基因；ABCC亚家族有19条基因。选择在佛手正常果表达量高的CmABCB19与CmABCC10进一步研究。

　　将佛手转运蛋白CmABCB19、CmABCC10与拟南芥、水稻等物种功能已知的ABC转运蛋白进行比对，推测佛手CmABCB19可能具有生长素转运功能，CmABCC10可能具有类黄酮成分转运功能。同时测定佛手中生长素和类黄酮成分的含量。与佛手正常果相比，在异形果中生长素IAA、芦丁和橙皮素含量低；柚皮苷、香叶木苷和川陈皮素含量高。

　　在烟草瞬时转化体系中进行转运蛋白的亚细胞定位，CmABCB19在细胞质膜上表达，CmABCC10在液泡膜上表达。在酿酒酵母中探究转运蛋白的转运底物和转运方向，以IAA为底物，yap1-CmABCB19细胞中生长素积累量显著低于突变株yap1-pYES2，说明转运蛋白CmABCB19在酿酒酵母中具有生长素转出作用。分别以五种类黄酮成分为底物，与突变株ycf1-pYES2相比，互补突变株ycf1-CmABCC10中柚皮苷、川陈皮素与香叶木苷积累量低，芦丁和橙皮素积累量高，说明CmABCC10转运蛋白在酿酒酵母中具有介导柚皮苷、川陈皮素、香叶木苷转出，介导芦丁、橙皮素转入的作用。

　　为进一步探究转运蛋白调控果实发育的功能，借助拟南芥野生型、突变株，互补株系和过表达株系进行研究。与Col-0相比，突变株abcb19的角果短，说明AtABCB19参与角果发育；突变体互补CmABCB19后，角果长度部分恢复，说明CmABCB19功能与AtABCB19相似；CmABCB19异源过表达植株角果变短，种子变小变轻。与Col-0相比，突变株abcc10的角果短，说明AtABCC10参与角果生长；突变体互补CmABCC10后，角果长度恢复，说明CmABCC10功能与AtABCC10相似；CmABCC10异源过表达植株角果变短，种子变小变轻。表明转运蛋白CmABCB19与CmABCC10参与果实生长发育。

　　采用UPLC-MS/MS和转录组测序分别检测转基因拟南芥果实中IAA和芦丁含量，以及生物合成通路中关键基因的表达水平。与Col-0相比，拟南芥突变株abcb19的IAA含量降低；互补CmABCB19后IAA含量升高；CmABCB19过表达植株的IAA含量升高，结合转录组推测CmABCB19通过影响YUC家族的表达改变生长素的生物合成。在拟南芥突变株abcb19中，芦丁含量降低，但CmABCB19互补后未能恢复，说明CmABCB19不直接参与芦丁的生物合成积累。与Col-0相比，拟南芥突变株abcc10含量低；互补CmABCC10后，芦丁含量显著增加；过表达CmABCC10的拟南芥中，芦丁含量也显著降低。结合转录组结果，推测CmABCC10通过调控4-香豆酰辅酶A连接酶4CL2/3、查尔酮合成酶CHS、查尔酮异构酶CHI和黄酮醇合成酶FLS1/3参与类黄酮生物合成。与Col-0相比，abcc10突变体IAA含量降低，CmABCC10互补后，IAA含量显著增加，说明CmABCC10可参与生长素的合成积累。

　　综上所述，该研究筛选到调控异形果形成的关键基因CmABCB19与CmABCC10，发现CmABCB19为细胞膜转运蛋白，参与生长素转运；CmABCC10为液泡膜转运蛋白，参与类黄酮成分转运。同时CmABCB19与CmABCC10都参与调控生长素和类黄酮的合成，进而引发果实表观性状及内在品质特征改变。

　　中国中医科学院医学实验中心袁媛研究员、陕西中医药大学焦红红为该文的共同通讯作者，中国中医科学院张敏博士研究生为该文的第一作者。该研究由中国中医科学院科技创新工程（CI2023D001/CI2023E00204/CI2021B014）、国家杰出青年科学基金（82325049）、中央公益性研究机构基本研究经费（ZZXT202102）、中国中医科学院名贵中药资源可持续利用能力建设项目（2060302）资助。

张敏 分子生药创新团队